在real-time PCR中如何检测DNA污染

既然把DNA叫做污染，那应该是对RNA反转录后进行Real-time了。
你用未进行反转录的RNA作为模板，跑一次检测Real-time。如果没有DNA污染，这次RT是不会得到扩增结果的，因为RNA不能作为普通Taq酶的模板；一旦RNA样品里面有DNA污染，那检测RT出现扩增产物的可能性非常高。
只要RNA作为模板的Real-time PCR得到了扩增结果，那就是存在DNA污染。
PCR产物的融解曲线必须做，而且你也必须得知道这对引物二聚体的融解峰，防止引物二聚体误导结果。

DNA测序方法有哪些

第1 代测序技术——荧光标记的Sanger 法
第一代就不说了。
第2 代测序技术——循环阵列合成测序法
述第2 代测序技术中, 序列都是在荧光
或者化学发光物质的协助下, 通过读取DNA 聚合酶
或DNA 连接酶将碱基连接到DNA 链上过程中释放
出的光学信号而间接确定的. 除了需要昂贵的光学
监测系统, 还要记录、存储并分析大量的光学图像.
这都使仪器的复杂性和成本增加. 依赖生物化学反
应读取碱基序列更增加了试剂、耗材的使用, 在目前
测序成本中比例相当大. 直接读取序列信息, 不使用
化学试剂, 对于进一步降低测序成本是非常可取的.
在一个正在发生突破瓶颈巨变的领域内, 很难准确
预测未来将发生什么.
第3 代测序技术——直接测序
将基因组DNA 随机切割成大约100 kb 左右的片段,
制成单链并与六寡聚核苷酸探针杂交. 然后驱动结
合了探针的基因组文库片段通过可寻址的纳米孔阵
列. 通过每个孔的离子电流均可独立测量. 追踪电流
的变化确定探针杂交在每个基因组片段上的精确位
置. 利用基因组片段上杂交探针的重叠区域将基因
组片段文库排列起来, 建立一组完整的基因组探针
图. 利用计算机算法, 获得完整的基因组序列.

如何使用简单的实验方法检测DNA纯度

实验原理

DNA/RNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。因此，可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度，OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA。如用25px光径，用 H2O稀释DNA/RNA样品n倍并以H2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：

DNA（ug/ml）=50×OD260读数×稀释倍数。

RNA（ug/ml）=40×OD260读数×稀释倍数。
DNA/RNA纯品的OD260/OD280为1.8或2.0，故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度。若比值较高说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在.本实验室机器显示是OD260\OD230，则比值应在2-2.5之间，偏小则说明有残余盐剩余。

实验步骤
1. 将制备的DNA悬浮溶解于TE缓冲液中[pH8.O, 1Ommo1/L的Tris缓冲液,内含〈1mmol/L EDTA〉]或悬浮溶解在灭菌水中(依据DNA含量加水)。
2. 用可扫描的紫外分光光度计测定制备的DNA/RNA的紫外吸收曲线，测定OD260和OD280，并计算比值：OD260/OD280，纯DNA的此比值约为1.8～2.0。纯RNA的此比值约为大于2.0。
3. 根据：每毫升1微克的纯DNA的OD260值= 0.020，计算所得DNA的纯度；
每毫升1微克的纯RNA的OD260值= 0.025，计算所得RNA的纯度；

并讨论纯度较低的原因和解决办法。
260、320、230、280nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般的，只看OD260/OD280（Ratio，R）。

DNA: OD260/OD280比值应接近1.80，若R值大于1.8。说明存在RNA，可重新用RNaseA处理,酚:氯仿:异戊醇(23:24:1)抽提。若R值小于1.8，则说明有蛋白质等杂质存在，需再用蛋白酶K、SDS及盼、氯仿、异戊醇重新对DNA进行纯化（也可加入1/8体积的3M NaAc(pH5.2)与冷乙醇一同促使DNA沉淀析出。

RNA: OD260/OD280比值在1.8-2.0时，认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当你用Tris作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2（一般应该是<2.2的）。当R<1.8时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显，你可以根据自己的需要决定这份RNA的命运。当R>2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。

注意事项：
1. 有用品均需要高温高压，以灭活残余的DNA酶/RNA酶。

2. 所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制，RNA均用DEPC处理的水。

3. 用大口滴管或吸头操作，以尽量减少打断DNA的可能性。